دانشگاه ازاد اسلامي
واحد دامغان
دانشکده علوم پايه
رساله براي دريافت درجه کارشناسي ارشد در رشته بيوتکنولوژي
گرايش ميکروبي
عنوان
طراحي، اناليز بيوانفورماتيکي، همسانه سازي و بيان مولتي توپ انتي ژن اختصاصي کارسينوماي سلول هاي سنگفرشي مري
استاد راهنما
دکتر محمد مهدي فرقاني فرد
استاد مشاور
دکتر محمدرضا عباس زادگان
نگارنده
علي قمري
شهريور 1393
فهرست مطالب
عنوان صفحه
چکيده فارسي…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 1
فصل اول: مقدمه
1-1 سرطان مري……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 3
1-1-1 تعيين مرحله بيماري………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 4
1-1-2 عوامل خطرزا در ابتلا به سرطان مري…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 5
1-1-3 تغييرات مولکولي در سرطان مري………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 5
1-1-3-1 تغييرات مولکولي در EAC………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 5
1-1-3-2 تغييرات مولکولي در EACC…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 6
1-1-4 درمان هاي رايج سرطان مري…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 6
1-1-4-1 جراحي…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 7
1-1-4-2 راديوتراپي……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 7
1-1-4-3 شيمي درماني……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 8
1-1-4-4 ليزر درماني……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 8
1-1-4-5 فتوديناميک……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 8
1-2 پروتئين EpCAM……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 9
1-3 مسأله ي تحقيق…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 12
فصل دوم: مروري بر تحقيقات انجام شده
2-1 EpCAM در درمان سرطان……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 13
فصل سوم: مواد و روش ها
3-1 مواد مورد استفاده…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 17
3-1-1 باکتري مورد استفاده……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 17
3-1-2 پلاسميد…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 17
3-1-3 انزيم ها……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 17
3-1-4 کيت هاي ازمايشگاهي……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 18
3-1-5 انتي بيوتيک ها………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 18
3-1-6 محيط کشت باکتري………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 18
3-1-7 ژل الکتروفورز…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 18
3-1-8 مواد شيميايي………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 18
3-1-9 وسايل و تجهيزات ازمايشگاهي……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 18
3-2 طراحي و اناليز بيوانفورماتيکي مولتي توپ پروتئين EpCAM………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 22
3-2-1 طراحي مولتي توپ کايمر………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 22
3-2-2 بهينه سازي توالي يا Optimization…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 23
3-2-3 پيش بيني ايميوژنيک اپي توپ هاي سلول هاي B………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 23
3-2-4 پيش بيني ايميوژنيک اپي توپ هاي سلول هاي T……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 23
3-2-5 پيش بيني ميزان تمايل اتصال اپي توپ ها به MHC…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 24
3-2-6 پيش بيني ساختار دوم mRNA…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 24
3-2-7 پيش بيني ساختار دوم پروتئين……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 24
3-2-8 شناسايي نواحي تداخل کننده…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 24
3-2-9 تعيين ساختار سوم پروتئين…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 24
3-2-10 تعيين ميزان انتي ژنيک بودن و محلول بودن پروتئين…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 24
3-2-11 تعيين ميزان پايداري پروتئين…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 25
3-3 سنتز شيميايي DNA کايمر طراحي شده……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 25
3-3-1 سنتز شيميايي ژن نوترکيب……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 25
3-3-2 پايداري و شرايط نگهداري DNA سنتز شده…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 25
3-3-3 محلول سازي DNA ليوفيليزه…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 25
3-4 کلونينگ پلاسميد- AMP+ pBSK حاوي DNA مولتي توپ EpCAM…………………………………………………………………………………………………………… 25
3-4-1 اماده سازي باکتري شايسته……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 26
3-4-1-1 مواد و محلول ها………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 26
3-4-1-2 روش کار……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 26
3-4-2 ترانسفورماسيون پلاسميد به سلول هاي مستعد TOP10 E.coli…………………………………………………………………………………………………………………………….. 27
3-4-2-1 روش کار……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 27
3-4-3 ارزيابي کلوني ها……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 27
3-4-4 استخراج پلاسميد – AMP+ pBSK حاوي DNA مولتي توپ EpCAM…………………………………………………………………………………………… 28
3-4-5 تاييد آنزيمي پلاسميد استخراج شده…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 30
3-4-5-1 هضم آنزيمي دوگانه يا Double digestion………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 30
3-4-5-2 الکتروفورز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 30
3-5 ساب کلونينگ ژن مولتي توپ EpCAM…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 32
3-5-1 تخليص DNA مولتي توپ EpCAM از ژل……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 32
3-5-2 لايگيشن…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 33
3-5-3 ترانسفورماسيون……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 34
3-5-3-1 اماده سازي سلول هاي شايسته…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 34
3-5-3-2 ترانسفورماسيون سلول هاي شايسته E.coli BL21(DE3) با محصول لايگيشن………………………………………………………… 35
3-5-4 ارزيابي کلوني ها……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 35
3-5-5 استخراج پلاسميد بياني pet-28a حاوي ژن مولتي توپ EpCAM……………………………………………………………………………………………………………………. 35
3-5-6 تاييد انزيمي پلاسميد استخراج شده…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 37
3-6 بيان پروتئين مولتي توپ EpCAM………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 38
3-6-1 القاء بيان پروتئين به کمک IPTG……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 38
3-6-2 بررسي بيان به کمک تکنيک SDS-page………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 38
3-6-2-1 روش ساخت محلول ها و ژل ها………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 39
3-6-2-2 Run کردن نمونه ها………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 40
3-6-2-3 رنگ اميزي با کوماسي G-250 کلوئيدي………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 40
فصل چهارم: نتايج
4-1 نتايج حاصل از طراحي و اناليز بيوانفورماتيکي پروتئين EpCAM……………………………………………………………………………………………………………………………………. 42
4-1-1 مولتي توپ کايمر طراحي شده………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 42
4-1-2 نتايج حاصل از بهينه سازي توالي يا Optimization…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 42
4-1-3 اناليز ساختار mRNA ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 46
4-1-4 ساختار دوم پروتئين……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 47
4-1-5 پيش بيني ايميوژنيک اپي توپ هاي شناسايي شونده توسط سلول هاي لنفوسيتB……………………………………………………… 48
4-1-6 پيش بيني اپي توپ هاي شناسايي شونده توسط سلول هاي لنفوسيت T………………………………………………………………………………………………. 50
4-1-7 پيش بيني تمايل اتصال پپتيد ها به مولکول MHC……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 50
4-1-8 شناسايي نواحي تداخل کننده…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 51
4-1-9 پيش بيني ساختار سوم پروتئين…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 51
4-1-10 نتايج حاصل از تعيين ميزان آنتي ژنيک بودن و محلول بودن پروتئين………………………………………………………………………………………………………. 52
4-1-11 بررسي پايداري پروتئين نوترکيب……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 53
4-2 سنتز شيميايي DNA کايمر طراحي شده نو ترکيب……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 54
4-3 کلونينگ پلاسميد- AMP+ pBSK حاوي DNA مولتي توپ EpCAM…………………………………………………………………………………………………………… 56
4-4 ساب کلونينگ ژن مولتي توپ EpCAM…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 58
4-5 بيان پروتئين مولتي توپ EpCAM و تائيد ان به کمک تکنيک SDS-page……………………………………………………………………………………………….. 61
فصل پنجم: بحث و نتيجه گيري
بحث…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 63
نتيجه گيري………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 72
منابع……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 73
چکيده انگليسي………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 78
فهرست شکل ها
عنوان صفحه
شکل1-1. ميزان مرگ و مير ناشي از سرطان مري در سال 2004 …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 4
شکل1-2. بيان مختلف پروتئين EpCAM در سلول نرمال و مراحل مختلف سرطاني شدن سلول سنگفرشي مري……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 10
شکل 1-3. ساختار پروتئين EpCAM و اپي توپ هاي شناسايي شونده توسط انتي بادي هاي اختصاصي ان……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 11
شکل 3-1. انکوباتور ممرت………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 19
شکل 3-2. شيکر انکوباتور ان بي اس………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 19
شکل 3-3. تانک الکتروفورز و دستگاه مولد ولتاژ…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 20
شکل 3-4. سانتريفيوژ اپندورف المان…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 20
شکل 3-5. بن ماري ممرت………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 21
شکل 3-6. ترموسايکلر پرکين المر……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 21
شکل 3-7. دستگاه تصويرساز ژل سينژن……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 22
شکل3-8. کيت استخراج پلاسميد فرمنتاز…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 28
شکل 3-9. کيت استخراج DNA از ژل فرمنتاز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 32
شکل 4-1. نماي شماتيک مولتي توپ طراحي شده……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 42
شکل 4-2. شاخص سازگاري کدون……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 43
شکل 4-3. ميزان فراواني کدون هاي بهينه…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 44
شکل 4-4 شاخص محتواي G-C…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 45
شکل 4-5. ترادف مولتي توپ ژني مورد نظر پس از بهينه سازي کدون هاي مربوطه جهت بيان در ميزبان E.coli………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 45
شکل 4-6. مقايسه نوکلئوتيد بصورت نظير به نظير در توالي هاي اوليه و بهينه سازي شده……………………………………………………….. 46
شکل 4-7. ساختار دوم mRNA پيش بيني شده بعد از بهينه سازي………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 47
شکل 4-8. پيش بيني ساختار دوم پروتئين……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 48
شکل 4-9. اپي توپ هاي خطي ساختار مولتي توپ پروتئيني براي لنفوسيت B…………………………………………………………………………………………… 49
شکل 4-10. اپي توپ هاي غير خطي ساختار مولتي توپ پروتئيني براي لنفوسيت B ……………………………………………………………………. 49
شکل 4-11 . اپي توپ هاي شناسايي شونده توسط سلول هاي لنفوسيت T در ساختار مولتي توپ نوترکيب با استفاده از پايگاه CTLpred…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 50
شکل 4-12. پيش بيني تمايل اتصال پپتيد ها به مولکول MHC……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 51
شکل 4-13 پيش بيني نواحي تداخل کننده در ساختار پروتئين………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 51
شکل 4-14. ساختار سوم پروتئين…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 52
شکل 4-15. ميزان در دسترس بودن اسيد هاي امينه پروتئين نوترکيب براي حلال……………………………………………………………………………………….. 53
شکل 4-16. نمودار راماچاندران اسيد امينه هاي پروتئين نوترکيب………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..54
شکل 4-17. تائيد اندازه ژن سنتز شده به کمک هضم انزيمي………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 55
شکل 4-18. نقشه ي ژني پلاسميد حاوي DNA نوترکيب مولتي توپ EpCAM…………………………………………………………………………………………. 56
شکل 4-19. تائيد حضور پلاسميد حاوي ژن مولتي توپ EpCAM در محصول استخراج پلاسميد……………………. 57
شکل 4-20. هضم دوگانه انزيمي پلاسميد تکثير يافته pBSK……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 58
شکل 4-21. نقشه ژني پلاسميد pet-28a ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 59
شکل 4-22. باکتري هاي BL21(DE3) ترانسفورم شده با pet-28a حاوي ژن مولتي توپ…………………………………………. 60
شکل 4-23. تائيد حضور پلاسميد pet-28a حاوي ژن مولتي توپ EpCAM در باکتري ترانسفورم شده BL21(DE3)………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 60
شکل 4-24.نتيجه حاصل از هضم انزيمي دو گانه پلاسميد pet-28a حاوي ژن مولتي توپ
EpCAM…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 61
شکل 4-25. بررسي بيان پروتئين مولتي توپ EpCAM به کمک تکنيک SDS-page………………………………………………………………………….. 62
چکيده
مقدمه
سرطان مري به عنوان ششمين سرطان شايع و عامل مرگ و مير بر اثر سرطان در بين افراد مي باشد. با وجود روش هاي درماني موجود مانند جراحي، راديوتراپي و شيمي درماني، ميزان بقاء پنج ساله بيماران در حدود %10 تا %13 مي باشد. فقدان علايم زودرس اوليه موجب مي شود که در زمان تشخيص، بيماري در مراحل پيشرفته باشد. کارسينوم سلول هاي سنگفرشي مري يکي از دو نوع سرطان مري است که بيشتر در مردان و افراد بالاي 50 سال سن ديده مي شود. بيان مولکول چسبندگي سلول هاي اپي تليالي يا EpCAM در انواع سرطان هاي گوارش به خصوص سرطان مري افزايش مي يابد. هم چنين در مراحل مختلف سرطاني شدن، با پيشرفت بيماري، بيان ان بيشتر مي شود. از اين جهت مي توان از ان به عنوان مارکري مناسب جهت درمان سرطان استفاده کرد. در اين مطالعه ما بر ان شديم که با استفاده از دو اپي توپ ايميونوژن پروتئين EpCAM و اتصال انها به کمک لينکري مناسب، يک مولتي توپ کايمريک ايميونوژن ايجاد و زمينه را براي استفاده از ان جهت توليد واکسن و يا کيت تشخيصي سرطان مري فراهم کنيم.
روش کار
در اين مطالعه ابتدا اپي توپ هاي مورد نظر به کمک بانک هاي اطلاعاتي ژني انتخاب شدند. سازه ي نو ترکيب طراحي شد. سپس با اناليز هاي بيو انفورماتيکي و کامپيوتري، خواص مهم مثل پايداري، انرژي، فولدينگ مناسب، ايمني زايي و … ، که در سنتز اين مولتي توپ مهم هستند را مورد بررسي قرار داديم. ژن طراحي شده به روش شيميايي سنتز شد و سپس با استفاده از فرايند کلونينگ، قطعه ژني سنتز شده را به کمک پلاسميد بياني pet-28a درون سيستم پروکاريوتي انتقال داده و تکثير کرديم. در انتها نيز بيان مولتي توپ کايمريک طراحي شده را در باکتري هاي نو ترکيب با القاگر مناسب القا کرده و وجود پروتئين مورد نظر را به کمک تکنيک SDS-page مورد بررسي قرار داديم.
بحث و نتيجه گيري
مولتي توپ کايمر طراحي شده داراي پايداري و انرژي مناسبي بوده و مي تواند به مانند اپي توپ هاي پروتئين اصلي خاصيت ايمني زائي داشته باشد. اين قطعه ژني توانايي کلون شدن در ميزبان پروکاريوتي را دارا بوده و باکتري قادر است به کمک القاگر مناسب به ميزان فراواني پروتئين کايمريک مورد نظر را توليد کند. از اين جهت مي توان از اين پروتئين نوترکيب براي تهيه کيت تشخيصي سرطان مري به واسطه تکنيک الايزا استفاده برد. همچنين مي توان با تزريق اين پروتئين نوترکيب به عنوان واکسن، سيستم ايمني فرد را جهت پيش گيري از ابتلا به سرطان تقويت نمود.
واژه هاي کليدي: سرطان مري، EpCAM، مولتي توپ کايمر، کلونينگ
فصل اول: مقدمه
1-1 سرطان مري
سرطان مري1 با نزديک به 000/400 مورد منجر به مرگ در سال، ششمين عامل مرگ ومير ناشي از سرطان در جهان است. ميزان مرگ ومير ناشي از سرطان مري در سال، از حدود 3 در105 نفر در سفيد پوستان ايالات متحده آمريکا تا بيش از 100 در 105 نفردر برخي از نواحي کشور چين متغير است. اين سرطان به انواع گوناگوني تقسيم ميشود که دو نوع کارسينوم سلول هاي سنگفرشي مري2(ESCC) و آدنوکارسينوم مري3 (EAC) آن بسيار رايج است. (کمانگر و همکاران، 2007) اگر چه عامل هاي خطر و اپيدميولوژي ESCC و EAC با هم متفاوت اند ، اما پيش آگاهي هر دو بسيار ضعيف است به نحوي که بقاي پنج ساله بيماران ، 10 تا 13 درصد گزارش شده است. (سمپلينر و همکاران، 2009)4
در مورد تاريخچه ي بيماري، تا سال 1970 بيش از 90% سرطان مري از نوع سنگفرشي و نوع ادنوکارسينومايي تقريبا نادر بوده و از اين زمان به بعد نوع ادنوکارسينومايي رشد يکنواختي را شاهد بوده است. مطالعات ايپدميولوژي گسترده اي در کشورهاي مختلف در زمينه عامل هاي خطر، بروز وشيوع انجام گرفته است . در مطالعات انجام گرفته در زمينه ي بروز EAC در ايالات متحده آمريکا ، مشخص شده است که در سال 2000 سرعت افزايش بروز آن نسبت به ساير سرطان ها پيشي گرفته است و رشدي بين 3 تا 5 برابر در نژادهاي مختلف در فاصله ي زماني بين سال هاي 1975 تا 2004 گزارش شده است. (دميستر، 2009)5 در سال 2009 در ايالات متحده آمريکا ، EAC دو سوم موارد سرطان مري را به خود اختصاص داده است. (ژو، 2009)6 اين درحالي است که در کشورهاي شرق آسيا و آسياي مرکزي از جمله ايران ، ESCC رايج تر است. (دميستر، 2009) مطالعات انجام شده در ايران نشان دهنده ميزان بالاي خطر ابتلا به سرطان مري در نواحي ساحلي درياي خزر بويژه در استان گلستان است. (کمانگر و همکاران، 2007) هم چنين مطالعات سال 2008 که در استان کرمان انجام گرفته است بيان گر افزايش 11 درصدي خطر ابتلا به EAC در سال است ، در حالي که خطر ابتلا به ESCC کم و بيش ثابت بوده است. (حق دوست و همکاران، 2008) در شکل 1-1، براورد حاصل از ميزان شيوع و مرگ و مير ناشي از سرطان مري در جهان در سال 2004، نشان داده شده است.
شکل1-1. ميزان مرگ و مير ناشي از سرطان مري در سال 2004. داده ها در مقياس هر 100.000 نفر محاسبه شده اند. (سازمان بهداشت جهاني، 2009)7
1-1-1 تعيين مرحله بيماري
تشخيص مرحله بيماري يکي از مهم ترين مواردي است که در چگونگي درمان و وضعيت باليني تاثير دارد. تعيين مرحله ي بيماري، کوششي دقيق جهت اطلاع از توسعه و پيشرفت سرطان و اين که سرطان به چه قسمت هايي از بدن بيمار پيشرفت کرده است، مي باشد. هم چنين به پزشک کمک مي کند تا برنامه ي درماني را طراحي نمايد.
چهار مرحله بيماري عبارت است از :
مرحله ي I : سرطان تنها محدود به لايه هاي بالايي سلول هاي مخاط مري است.
مرحله ي II : سرطان لايه هاي عميق تر مخاط مري را در بر گرفته يا به عقده هاي لنفاوي مجاور مري انتشار پيدا کرده است. در اين مرحله، سرطان به ديگر قسمت هاي بدن انتشار نمي يابد.
مرحله ي III : سرطان بصورت عميق داخل ديواره ي مري را مورد تهاجم قرار داده است و به بافت ها يا عقده هاي لنفاوي مجاور مري انتشار پيدا نموده است. سرطان هنوز به ديگر قسمت هاي بدن انتشار پيدا نکرده است.
مرحله ي IV : سرطان به ساير قسمت هاي بدن انتشار يافته است. سرطان مري تقريبا در هر قسمتي از بدن بيمار مانند کبد، ريه ها، مغز و استخوان ها مي تواند انتشار يابد. (فرقاني فرد، 2010)
1-1-2 عوامل خطر زا در ابتلا به سرطان مري
اين سرطان مانند ديگر سرطان ها حاصل مجموعه اي از عوامل محيطي و تغييرات ژنتيکي است . عامل هاي خطر در EAC و ESCC با هم متفاوت است ، به عنوان مثال عامل هاي محيطي و رژيم غذايي به شدت با ESCC در ارتباط هستند اما رفلاکس ( جريان برگشتي )، معدي- مروي8 مکرر و واکنش هاي التهابي پس از آن نقش بسيار مهمي در ابتلا به EAC دارد . (ژو، 2009) دود تنباکو ، مصرف الکل ، سوء تغذيه ، کمبود سلنيوم ، کمبودي روي را مي توان از عوامل محيطي مهم موثر نام برد. (کمانگر و همکاران، 2007) طبق مطالعات انجام شده توقف مصرف الکل و تنباکو خطر ابتلا به اين سرطان را بسيار کاهش مي دهد. (جاب و همکاران، 2009)9 به نظر مي رسد که ESCC همراه با ويروس پاپيلوماي انساني 10 (HPV ) معمولا در کشورهايي که خطر بالاتري براي ESCC دارنده رايج تر است . HPV ويروسي است که علت اصلي سرطان گردن رحم محسوب مي شود. مطالعات انجام شده در سال 2002 نشان داده است که DNA اين ويروس در 2/15 درصد ESCC ها وجود دارد . ( حسين11 و همکاران، 2009 : هررا 12و همکاران، 2009)
1-1-3 تغييرات مولکولي در سرطان مري
در ايجاد سرطان، عوامل مولکولي و ژنتيکي نيز مي توانند دخيل باشند که در مورد سرطان مري اين عوامل مي تواند با توجه به نوع ان متفاوت باشد :
1-1-3-1 تغييرات مولکولي در EAC
رفلاکس معدي – مروي مزمن به عنوان مهم ترين عامل تاثيرگذار در ايجاد EAC در نظر گرفته مي شود . افزايش خطاهاي کروموزومي ، تغييرات ژنتيکي ويژه و ناهنجاري هاي اپي ژنتيکي ژن هاي سرکوب گر تومور ، مشخص کننده اين بدخيمي مي باشد . تغييرات ديگر شامل افزايش فعاليت تلومراز و تغييرات اپي ژنتيکي مانند متيله شدن مضاعف از ديگر عوامل مولکولي در EAC هستند . (جاب و همکاران، 2009)
1-1-3-2 تغييرات مولکولي در ESCC
بر خلاف آدنوکارسينوم مري ، عامل هاي خطر و سازوکارهاي متفاوت مولکولي در ايجاد ESCC نقش دارند. (جاب و همکاران، 2009) نمونه هاي مرسوم ژن هاي سرکوب گر تومور شامل Rb و P53 است که مطالعات ، نقش جهش در اين دو ژن را در مراحل آغازين ESCC نشان داده است . از ديگر عوامل، جهش در ژن BCL-2 که نقش ضد آپوپتوزي دارد، مي توان نام برد. (جاب و همکاران، 2009 ; نوري دلوئي و يعقوبي، 1999) يکي از عامل هاي تاثير گذار روي عملکرد ژن هاي سرکوب کننده تومور، ريزماهواره ها13 هستند . تغييرات در اين ريزماهواره ها مي تواند سلول هاي طبيعي را به سلول هاي ناميرا و نئوبلاستي تبديل کند . برخي از جايگاه هاي ريزماهواره ها و جايگاه هاي ژن هاي سرکوب کننده تومور در نزديکي هم قرار گرفته اند که به نام نقاط داغ معروف هستند و در غير فعال کردن ژن هاي سرکوب کننده تومور نقش دارند. (نوري دلوئي، 2009 ; ان14 و همکاران، 2005) از ديگر عوامل مي توان به تغييرات اپي ژنتيکي به ويژه متيله شدن بازهاي ناحيه ي پروموتر ژن اشاره کرد که موجب غير فعال شدن ژن هاي سرکوب کننده تومور و تنظيم چرخه ي سلولي مي شود . (نوري دلوئي و شريفي، 2001) مطالعات مولکولي سرطان مري، ناهنجاري هاي ژنتيکي مانند دگرگوني در بيان ژن هاي p53 ،p16 ، سيکلين D1 ، E-Cadherin ، C-myc و … را در EAC و ESCC نشان داده است . در بسياري از موارد دگرگوني هاي ژنتيکي معيني به طور مشترک در EAC و ESCC مشاهده شده است . اما در برخي از موارد بيان مکرر و نابه جاي ژن ها در يکي از انواع سرطان مري بيش از نوع ديگر ذکر شده است . بيان ژن هاي تغيير يافته اغلب با عامل هاي خطر سرطان مري ارتباط نزديکي دارند. ( اکا15 و همکاران، 2009 ; اينگراوالو16 و همکاران، 2009)
1-1-4 درمان هاي رايج سرطان مري
درمان وقتي ارزشمند است که در مراحل اوليه بيماري باشد زيرا کمتر از 20 درصد بيماران بعد از 5 سال زنده مي مانند. با اينکه پيش اگاهي سرطان مري در سه دهه اخير به شکل ارامي بهبود يافته است اما هنوز ميزان بقاي 5 ساله بيماران بسيار پايين است. دلايل مختلفي را مي توان مسبب ان دانست:
– عدم کفايت روش هاي غربال گري بيماران
– شناسايي سرطان در مرحله پيشرفته، به طوري که نيمي از بيماران در مرحله ي غير قابل جراحي و متاستاز قرار دارند.
– ريسک بالاي عود بيماري بعد از جراحي و شيمي درماني
– عدم دسترسي به يک روش غير تهاجمي قابل اطمينان
– بقاء محدود در مورد بيماران غير قابل جراحي و متاستاتيک شيمي درماني شده به عنوان درمان تسکيني
درمان سرطان مري بستگي به عواملي از قبيل اندازه، موقعيت و وسعت تومور و سلامتي عمومي بيمار دارد. بيماران اغلب توسط گروهي از پزشکان متخصص شامل متخصصين گوارش، انکولوژيست باليني و انکولوژيست راديوتراپي درمان مي شوند. درمان سرطان، باعث تحريک دهان شده و خطر عفونت دهان را افزايش مي دهد، لذا پزشکان اغلب به مبتلايان سرطان مري توصيه مي کنند جهت معاينه ي دندان و درمان بيماري هاي ان، قبل از شروع درمان، به دندانپزشک مراجعه کنند.
درمان هاي متفاوت و ترکيب هاي درماني متعددي براي کنترل سرطان و يا بهبود کيفيت زندگي بيماران از طريق کاهش علايم و نشانه ها مورد استفاده قرار مي گيرد.
1-1-4-1 جراحي
شايع ترين درمان سرطان مري، جراحي است. معمولا جراح کل تومور يا قسمتي از مري و عقده هاي لنفاوي مجاور تومور و ساير بافت هاي ناحيه را بر ميدارد. عمل برداشتن مري ازوفاگوستومي نام دارد. جراح قسمت هاي سالم باقي مانده مري را به معده وصل مي کند. بنابر اين بيمار باز هم قادر به عمل بلع مي باشد. گاهي نيز از لوله هاي پلاستيکي يا بخشي از روده، جهت ارتباط بين مري و معده استفاده مي گردد. همچنين ممکن است جراح، مجراي بين معده و روده ي باريک را پهن تر کند تا محتويات معده اسان تر به درون روده ي باريک وارد شود. جراحي تمام تومور تنها در 40 درصد بيماران امکان پذير است و ممکن است سلول هاي توموري در حاشيه ناحيه ي تومور باقي بمانند. گاهي اوقات عمل جراحي بعد از اتمام ساير درمان ها انجام مي گيرد.
1-1-4-2 راديوتراپي
راديوتراپي استفاده از اشعه ي ايکس جهت از بين بردن سلول هاي توموري مي باشد. راديوتراپي فقط روي سلول هاي توموري تحت درمان موثر واقع مي شود. پرتو ممکن است از دستگاهي در خارج از بدن (راديوتراپي خارجي) و يا از مواد راديواکتيوي که درون يا مجاور تومور قرار داده مي شوند، خارج شود (راديوتراپي داخلي). لوله ي پلاستيکي به درون مري وارد مي شود تا در هنگام راديوتراپي مري باز نگه داشته شود. راديوتراپي ، بيمار را از عوارض جراحي مصون نگه مي دارد مخصوصا اگر اندازه يا موقعيت تومور عمل جراحي را مشکل افرين نمايد، اما غالبا اثر کمتري بر نشانه هاي انسدادي پيشرفت سرطان دارد و فقط مي توان آن را به عنوان راه درماني اوليه و سريع در نظر گرفت. راديوتراپي مي تواند به تنهايي يا همراه با شيمي درماني به کار گرفته شود. پزشکان از راديوتراپي به همراه شيمي درماني براي کوچک کردن اندازه تومور قبل از جراحي استفاده مي کنند. حتي اگر تومور را نتوان به وسيله ي جراحي خارج نمود و يا توسط راديوتراپي بطور کامل از بين برد، راديوتراپي اغلب به تسکين درد کمک کرده وعمل بلع را راحت تر مي سازد.
1-1-4-3 شيمي درماني
از ديگر روش هاي درماني، شيمي درماني است. شيمي درماني، کاربرد داروهاي ضد سرطان براي از بين بردن سلولهاي سرطاني است. داروهاي شيمي درماني مورد استفاده براي درمان سرطان مري در همه ي نقاط بدن پخش مي شوند. اين داروها به صورت تزريق داخل وريدي مورد استفاده قرار مي گيرند. مطالعات نشان داده است که شيمي درماني، باعث کاهش ابعاد تومور در 15 تا 20 درصد بيماران پس از معالجه ي تک دارويي و 30 تا 60 درصد بيماران بعد از معالجه ي چند دارويي همراه با راديوتراپي شده است . شيمي درماني همراه با پرتو درماني به طور همزمان طول عمر بيمار را نسبت به افرادي که يکي از اين روش ها استفاده کرده اند بيشتر مي کند.
1-1-4-4 ليزر درماني
ليزر درماني استفاده از نور با شدت بالا، براي از بين بردن سلول هاي سرطاني است. ليزر درماني فقط سلول هاي ناحيه ي تحت درمان را تحت تاثير قرار مي دهد. پزشک ممکن است از ليزر درماني براي از بين بردن بافت سرطاني و رفع انسداد مري، در صورتي که سرطان توسط جراحي از بين نرفته باشد، استفاده نمايد. رفع انسداد مري به کاهش علايم بيماري، خصوصا مشکلات مربوط به بلع کمک مي کند.
1-1-4-5 فتوديناميک
نوعي ليزر درماني است و شامل استفاده از داروهايي است که توسط سلول هاي سرطاني جذب مي شوند. هنگامي که سلول هاي سرطاني در معرض نور خاصي قرار بگيرند، داروها فعال شده وسلول ها را از بين مي برند. پزشک ممکن است از درمان فتوديناميک براي برطرف نمودن علائم سرطان مري مانند دشواري عمل بلع استفاده نمايد. (فرقاني فرد، 2010)
1-2 پروتئين EpCAM
مولکول چسبندگي سلول اپي تليال (EpCAM)17 که به نام آنتي ژن اختصاصي سلول اپي تليال و CD326 نيز ناميده مي شود يک گليکوپروتئين بين غشايي با وزن مولکولي 40 کيلو دالتون است . اين پروتئين داراي دو تکرار شبه فاکتور رشد اپيدرمال در دومين خارجي و يک دومين کوچک داخل سلولي حاوي دو جايگاه اتصال ?- اکتين است . ( ليتوينوف18 و همکاران، 1997-1994 ; بالزار19 و همکاران، 1998)
EpCAM داراي 314 آمينو اسيد است که به 3 قسمت تقسيم مي شود. يک دومين خارجي طولاني حاوي دومين شبه فاکتور رشد اپيدرمال و يک دومين تيروگلوبولين20 ، يک ناحيه بين غشايي کوچک و يک دم داخل سلولي 26 اسيد آمينه اي آن را تشکيل داده است . (وينتر21و همکاران، 2003 ; نوينک22 و همکاران، 2006 ; بلوني23 و همکاران، 2009) اين پروتئين اولين بار در سال 1979 به عنوان يک آنتي ژن شناسايي شد . اين پروتئين موجب القاي توليد آنتي بادي هاي مشخصي در موش ايميونيزه شده با سلول هاي سرطاني روده بزرگ انساني مي شود. (هرلين 24و همکاران، 1979) نام ژن بيان کننده اين گليکوپروتئين (epcam1) است که در جايگاه کروموزومي 2p21 قرار گرفته است. ( بائورل25 و گيرس26، 2007) اگر چه عملکرد چسبندگي و خاصيت اتصال بين سلولي آن در همان سال هاي نخستين کشف شده بود ، اما پتانسيل نقش سيگنالي آن در ايجاد سرطان اخيرا مورد توجه قرار گرفته است. (مولدنهاور27، 1987) مطالعات ايميونوهيستوشيميايي نشان داده است که بيان پروتئين EpCAM در تومورهاي بدخيم اپي تليالي بسيار افزايش پيدا مي کند. (شتي28 و همکاران، 1988 ; ديازارياس29 و همکاران، 1993) اين ميزان افزايش بيان در مراحل مختلف پيشرفت سلول هاي سرطاني مثل پيش از بدخيمي،بدخيمي، بعد از شيمي درماني، بعد از عود کردن مجدد و متاستاز مورد بررسي قرار گرفت و اين مطالعات موجب شد که پروتئين EpCAM به عنوان يکي از مارکرهاي مولکولي جهت هدف هاي درماني بيماران مبتلا به سرطان هاي مختلف دستگاه گوارش پيشنهاد شود. (استوپ30 و همکاران، 1992 ; پروونچر31 و همکاران، 1993 ; ماگوير32 و همکاران، 1994 ; پسبوسک فارو33 و همکاران، 2005)
شکل1-2. بيان مختلف پروتئين EpCAM در سلول نرمال و مراحل مختلف سرطاني شدن سلول سنگفرشي مري. A : سلول نرمال با بيان بسيار ضعيف. B: سلول توموري اوليه با بيان ضعيف و غير يکنواخت. C: سلول توموري ثانويه با بيان قوي و غير يکنواخت. D: سلول توموري نهايي با بيان قوي و يکنواخت. نواحي تيره نشان گر بيان بالاتر پروتئين EpCAM مي باشد. ( استوکلين و همکاران، 2006)34
مطالعات انجام شده بر روي ساختار پروتئين EpCAM نشان دهنده آن است که اين پروتئين در طي سنتز مي تواند توسط آنزيم هاي مختلف برش خورده و قطعه پپتيد سيگنالي آن حذف شده و در پروتئين نهايي که بر روي سطح سلول اپي تليال ظاهر مي شود وجود نداشته باشد . همچنين اين پروتئين داراي سه جايگاه اتصال آنتي بادي است که دوتاي آن به دومين خارج سلولي EpCAM اتصال مي يابند و ديگري مي تواند دم سيتوپلاسمي اين پروتئين را جهت اتصال شناسايي کند.
آنتي بادي مونوکلونال MOC31 ، موتيف خارج سلولي حد فاصل آمينواسيدهاي 27 تا 59 را شناسايي کرده و ديگر آنتي بادي مونوکلونال 311-1K2 ناحيه ي خارج سلولي حد فاصل آمينواسيدهاي 143 تا 164 را شناسايي مي کند . p6052 که يک پلي کلونال آنتي بادي است هم ناحيه ي داخل سلول در دم سيتوپلاسمي پروتئين حد فاصل آمينو اسيدهاي 301 تا 314 را شناسايي مي کند. (شنل35 و همکاران، 2013) در شکل 1-3 ، ساختار پروتئين EpCAM و جايگاه هاي شناسايي شونده توسط انتي بادي هاي اختصاصي ان نشان داده شده است.
مطالعات اخير نشان داده است که عملکرد پروتئين EpCAM تنها به خاصيت چسبندگي و اتصال آن خلاصه نمي شود بلکه مي تواند در پيام رساني سلولي، مهاجرت سلولي، تکثير و تمايز سلولي نيز نقش ايفا کند. (ترزپيس36 و همکاران، 2007 ; ماتزل37 و همکاران، 2009) ارتباط پروتئين EpCAM با تکثير، چسبندگي، تثبيت بافت، تحريک رشد توموري و متاستاز موجب شد اين پروتئين به عنوان يک مارکر جهت روش هاي درماني در مقابله با سرطان پيشنهاد شود. (بائورل و گيرس، 2007)

شکل 1-3. ساختار پروتيين EpCAM و اپي توپ هاي شناسايي شونده توسط انتي بادي هاي اختصاصي (شنل و همکاران، 2013)
1-3 مسأله ي تحقيق
در اين مطالعه ما در نظر داريم با طراحي، آناليز بيوانفورماتيکي ، کلونينگ و بيان يک مولتي توپ اپي توپ هاي ايمنوژنيک پروتئين غشايي EpCAM ، پتانسيل موجود براي بهبود روش هاي تشخيصي مثل توليد کيت هاي تشخيصي جهت تشخيص زودهنگام و پيش از بدخيم شدن سلول هاي سرطاني مري و همچنين گشايشي در توليد واکسن عليه سرطان مري را بررسي کنيم. در اين مطالعه فرضيه هاي زير مطرح شد.
– اپي توپ هاي ايمنوژنيک EpCAM را مي توان به صورت يک مولکول پلي توپ طراحي و آناليز کرد.
– مولکول طراحي شده از لحاظ فيزيکو شيميايي پايدار است .
– مولکول پلي توپ سنتز شده مي تواند در ميزبان مناسب کلون و بيان شود.
فصل دوم : مروري بر تحقيقات انجام شده
2-1 EpCAM در درمان سرطان
به دليل اينکه پروتئين EpCAM در سلول هاي طبيعي اپي تليال و هم در سلول هاي بنيادي نيز بيان مي شود اين سوال مطرح شد که آيا اين سلول ها نيز در طي درمان مورد هدف قرار مي گيرند يا خير. (ونت38 و همکاران، 2008 ; لسان39، 2012) دانشمندان پي برده اند که بيان پائين پروتئين EpCAM در سلول هاي طبيعي نسبت به سلول هاي توموري يکي از دلايلي است که اثرگذاري تکنيک هاي درماني بر پايه ي پروتئين EpCAM عوارض جانبي زيادي ندارد. (چائودري40 و همکاران، 2007) از جهتي ديگر مشاهده شده است که در بافت هاي طبيعي، پروتئين EpCAM بصورت يک کمپلکس بر روي سطح سلول ظاهر مي شود و مولکول هاي C09 ، CD44 وکلائودين-7 41 آن را احاطه کرده اند. در حالي که در سلول توموري پروتئين EpCAM بصورت منفرد و به ميزان فراوان بر روي سطح سلول تومور ظاهر مي شود. (استوکلين و همکاران، 2006) بنابراين احتمال اين که آنتي بادي هاي ضد EpCAM بتوانند در سلول هاي نرمال به آن متصل شوند بسيار پائين مي آيد . در سال 2001 مدل موشي ايجاد شد که مي توانست پروتئين EpCAM انساني را بيان کند. در اين مدل حيواني، اتصال قوي آنتي بادي MOC31 با سلول هاي توموري بيان کننده EpCAM نسبت به سلول هاي طبيعي اپي تليال مشاهده شد که نشان دهنده فراواني و در دسترس بودن پروتئين EpCAM در سلول هاي توموري بود.
در طي سال هاي اخير تلاش هاي گسترده اي براي توليد آنتي بادي هاي درماني بر عليه پروتئين EpCAM آغاز شد . اولين آنتي بادي مونوکلونال که بر عليه EpCAM مورد استفاده قرار گرفت، آنتي بادي ادرکولوماب 42 يا پانورکس 43 نام داشت . در اين مطالعه بيماراني که براي آن ها Edrecolomab تجويز شده بود، عود کردن تومور و همچنين سرعت مرگ و مير کاهش چشمگيري داشت. با اين حال در برخي موارد که در مقياس بالا اين آزمايش مورد بررسي قرار گرفت نتايج موفقيت آميز نبود . از دلايل اين شکست مي توان به نيمه عمر پائين آنتي بادي در سرم و تفاوت در ميزان بيان EpCAM در سلول هاي توموري طي مراحل مختلف سرطاني شدن اشاره کرد. واضح است که بيماران با بيان بالاي EpCAM مي توانند از اين شيوه درماني کمک بگيرند و تصادفي انتخابي کردن بيماران نيز حتما بايد در طي آزمايش مورد توجه قرار بگيرد.
آنتي بادي هاي عليه EpCAM زيادي با تمايل اتصال متفاوتي طراحي شد که از آن جمله آن ها مي توان به Edrecolomab کايمري ، 3622W94 ، ING-1 و آدکاتوموماب44 اشاره کرد . جالب بود که آنتي بادي هايي با تمايل اتصال بالا مثل 3622W94 و ING-1 حتي در غلظت هاي پائين پروتئين EpCAM قادر به اتصال با آن بودند . البته اين خاصيت موجب اتصال آنتي بادي ها به بافت هاي طبيعي و سالم نيز مي شد که خطر ريسک استفاده از آن ها را بالا مي برد . در مقايسه با چنين آنتي بادي هايي ، آنتي بادي با تمايل اتصال متوسط مثل Adecatumumab عوارض جانبي کمتري از خود نشان دادند. ( ايمريخ45 و همکاران، 2012)
در سال 2009 آنتي بادي کاتوماکسوماب 46 که عملکردي دو گانه ( anti-EpCAM و anti-CD3 ) داشت مورد تاييد اتحاديه اروپا قرار گرفت تا براي بيماران با تومور بدخيم و سرطان هاي EpCAM+ مورد استفاده قرار بگيرد . بيماران تحت درمان با catumaxomab نسبت به نمونه هاي کنترل داراي نشانه هاي کمتري از بدخيمي تومور در خود بروز دادند. (پاتريارکا47 و همکاران، 2011)
يکي از اهداف شيمي درماني رساندن داروها در دوزهاي موثر بصورتي ايمن و اثرگذار به جايگاه هاي وجود بيماري بدون تاثير بر بافت هاي سالم است . براي بهبود انتقال داروها امروزه از نانو تکنولوژي استفاده مي شود که عوارض جانبي را کاهش داده ، سمي شدن داروها را به حداقل مي رساند و راندمان درمان را بالا مي برد . با اين حال بدليل تنوع در ترکيبات کربوهيدراتي موجود در ساختمان آنتي بادي ها که مي تواند موجب سمي شدن آنتي بادي شده و خطر استفاده از چنين آنتي بادي هايي را بالا ببرد و همچنين به دليل اينکه نيمه عمر اکثر آنتي بادي ها در سرم بسيار کوتاه است، دانشمندان به فکر استفاده از عامل ديگري به جاي آنتي بادي ها افتادند . اپتامرهاي RNA اي جايگزين مناسبي به نظر مي رسيدند. امتياز اين مولکول ها، توليد ارزان تر و استحکام و ماندگاري بالاتر نسبت به آنتي بادي ها است . يکي از اين اپتامرها ، EPDT3 بود که حاوي فقط 19 نوکلئوتيد است و تمايل اتصال مشابهي با آنتي بادي هاي Adecatumumab و Catumaxomob دارد. EpDT3 بعد از اتصال با پروتئين EpCAM از طريق اندوسيتوز وارد سلول مي شود، بنابراين مي توانست به عنوان يک انتقال دهنده داروهاي شيمي درماني، سم ها و راديوايزوتوپ هاي درماني به کار گرفته شود. اما اين اپتامر ها قادر بودند پروتئين هاي EpCAM در مقياس پائين را نيز شناسايي کرده و بافت هاي طبيعي بدن را نيز مورد هدف قرار دهند. (پائولي48 و همکاران، 2003 ; لي49 و همکاران، 2014)
Huks-IL2 يک ايمنو سايتوکان کونژوگه حاوي آنتي بادي اختصاصي پروتئين EpCAM است که از انتهاي خود با دو مولکول اينترلوکين 2 ( IL-2 ) متصل شده است . اتصال اين ساختار به سلول هاي توموري با بيان بالاي EpCAM موجب مي شود تا از طريق مولکول IL-2 خود، توليد سلول هاي T کشنده را افزايش داده و همچنين از طريق سلول هاي کشنده طبيعي50(NK Cells ) سيستم ايمني ذاتي را در محيط اطراف تومور فعال کند. ( کانر51 و همکاران، 2013)
برخي اوقات درصد گليکوزيله شدن پروتئين EpCAM در سرطان هاي مختلف و همچنين در مراحل مختلفت پيشرفت سرطان متفاوت است . به همين دليل آنتي بادي هايي که ساختار فضايي کربوهيدرات هاي متصل به EpCAM ، در تشخيص پروتئين توسط آن ها موثر است توانايي چنداني جهت اتصال به پروتئين EpCAM ندارند، آنتي بادي مونوکلونال Ho-3 که از آنتي بادي Catumaxomab مشتق شده است براي اتصال به پروتئين EpCAM به کربوهيدرات هاي متصل به پروتئين نياز ندارد و مي تواند بدون حساسيت به سطح گليکوزيله شدن پروتئين به آن متصل شود . بنابراين توانايي گسترده اي براي اتصال به تومورهاي EpCAM+ متنوع دارد. (راف52 و همکاران، 2007)
آنتي بادي هاي دو اختصاصيتي53 (bs Ab ) مولکول هايي هستند که نسبت به دو آنتي ژن اختصاصيت دارند و کلاس جديدي از عوامل درماني ايمني زايي را شکل مي دهند. (فيشر54 و لجر55، 2007 ; مولر56 و کونترمان57، 2007) يکي از کاربردهاي چنين آنتي بادي هايي اتصال به آنتي ژن هاي توموري از يک سمت و اتصال به سلول هاي ايمني از طريق بازوي ديگر خود هستند که موجب فعال شدن سلول هاي ايمني از طريق غير مستقيم براي از بين بردن سلول هاي توموري مي شود. (زيدلر58 و همکاران، 1999و2000 ; راف و ليندهافر59، 2001 ; رويش60 و همکاران، 2006)
EpCAMxCD3 يکي از bsAB هايي است که موجب ليز سلولي در سلول هاي سرطان تخمدان مي شود. (استراوس61 و همکاران، 1999 ; مارمه62 و همکاران، 2002) EpCAMxCD3 با نزديک کردن سلول هاي سرطاني و سلول هاي T کشنده بطور غير مستقيم موجب از بين بردن سلول سرطاني مي شود . آن ها از طريق يک بازوي خود به مولکول CD3 لنفوسيت متصل شده و از طريق بازوي ديگر به پروتئين EpCAM سلول هاي توموري متصل مي شوند. با فعال شدن لنفوسيت ، سايتوکاين هاي مختلفي مانند TNF-? ، IFN-? ، گرآنزيمB و پرفورين توليد مي شوند. (سالنيکوف63 و همکاران، 2009 ; موتوشي64 و همکاران، 2012)
ING1 يا heMAb يک IgG مهندسي ژنتيک شده است که به پروتئين EpCAM با تمايل اتصال بالايي متصل مي شود و سلول هاي آدنوکارسينوما را در شرايط آزمايشگاهي از بين مي برد ولي در شرايط فيزيولوژيک، تنها از رشد تومور جلوگيري مي کند . مکانيزم عمل آن از طريق فرايند (ADCC) يا از بين بردن سلول با واسطه آنتي بادي 65 است . طبق مطالعات انجام شده استفاده از ING1 در مراحل اوليه ي متاستاز سلول هاي سرطاني مي تواند مفيد باشد. (روان66 و همکاران، 2003)
از منظري ديگر ، يکي از راه هاي مورد استفاده در طي درمان سرطان، پائين آوردن بيان ژن پروتئين EpCAM به کمک RNA هاي آنتي سنس است که در نهايت منجر به کاهش سرعت تکثير و متابوليسم سلول هاي سرطاني مي شود . (ابينگر67 و همکاران، 2013) دانشمندان در يکي از اين موارد با استفاده از مولکول هاي SiRNA توانستند بيان ژن EpCAM را در سلول هاي سرطاني سينه به شدت کاهش داده و در نتيجه تکثير و مهاجرت سلول هاي سرطاني سينه را به بافت هاي مجاور محدود کنند. (استا68 و همکاران، 2004 ; وينکلر69 و همکاران، 2009)
از ديگر روش هاي خاموش کردن ژن epcam استفاده از پروتئين انگشت روي70 است که مي تواند به پروموتر ژن متصل شود و از بيان آن جلوگيري کند. (گومانس71 و همکاران، 2007)



قیمت: تومان


پاسخ دهید